Nature｜绘制变构位点图谱，攻克不可成药难题

目前数千种蛋白质已经被验证为是数百种人类疾病的治疗靶点，然而很少有药物能够被成功靶向，且很多被认为是“无法成药的”¹。对于通过蛋白质互作发挥功能的蛋白质而言直接抑制结合界面难度较大，需要确定变构位点。然而目前大多数蛋白质没有已知的变构位点，也不存在全面的变构图谱。

GTPase KRas (KRAS)在约10%的癌症中发生突变²，作为一种典型的分子开关，其在不活跃的GDP结合状态和活跃的GTP结合状态之间循环³。尽管它在40年前就被确定为一种癌蛋白，但直到最近才有KRAS抑制剂被批准用于临床应用。Sotorasib是一种KRAS变构抑制剂，它结合在核苷酸和效应结合位点外，将KRAS(G12C)锁定在无活性的GDP结合状态，从而减少效应结合⁴。因此与直接抑制蛋白质活性位点相比，靶向变构位点更具特异性，且能减少副作用。

2023年12月18日，西班牙巴塞罗那科学技术学院的Ben Lehner 团队在Nature上发表题为“The energetic and allosteric landscape for KRAS inhibition”的研究性论文。该研究绘制了KRAS中抑制性变构交流的多个全局图谱，量化了超过26000个突变对KRAS折叠及其与六个互作蛋白结合的影响，并通过双突变体中的基因互作进行了大规模的生物物理测量，推断出超过22000个因果自由能变化。这些能谱量化了突变如何调节信号蛋白的结合特异性，并绘制了重要治疗靶点的抑制变构位点图。

为了全面绘制KRAS的抑制性变构交流图谱，作者采用了多维深度突变扫描的方法。通过两轮切口诱变构建了三个KRAS突变体文库，其中包含了超过26500个KRAS突变体，均为单氨基酸或双氨基酸突变（图 1a-d）。作者首先量化了这些KRAS突变体与效应蛋白RAF1的RAS结合域（RBD）的结合。蛋白片段互补测定（BindingPCA）实验表明RAF1结合界面或核苷酸结合口袋的突变强烈抑制了结合，并且这种变化是由于KRAS折叠丰度的变化所引起的（图1e, i）。为了了解突变对KRAS折叠和结合的影响，作者进一步使用AbundancePCA来量化KRAS突变体的细胞丰度，并将BindingPCA与AbundancePCA的组合方法称为双深PCA（ddPCA）。绘制每个突变体的RAF1结合与其细胞丰度的关系表明，许多变化确实可以用KRAS丰度的降低来解释（图1j），但也有很多无法用其解释（图1j中的红点）。

蛋白质的折叠和结合与折叠自由能(AGf)和结合自由能(AGb)的变化有关，这是通过从玻尔兹曼分布推导出的非线性函数实现的（图1b）。ddPCA是一种有效的实验设计，能够产生足够的数据来推断突变的因果生物物理效应。作者将KRAS库中遗传背景的选择偏向于具有弱有害影响的突变，结合MoCHI软件包将三态热力学模型拟合到数据中（图1c）。拟合模型非常好地预测了双氨基酸突变体数据，有力地支持了大多数自由能变化加性地结合在一起的假设，这些推断的自由能变化与体外测量高度相关（图1k）。总的来说，3,453个单氨基酸取代中有2,241个对折叠有害，3,301个中有843个对结合有害（图1g, h），且对折叠有害的突变富集在蛋白质的疏水核心（图1l）。

图1. 绘制KRAS折叠以及结合RAF1的能量图谱

相比之下，增加结合自由能的突变在结合界面中富集（图2a），在识别结合界面的每个位点突变后，平均绝对结合自由能都会发生变化（图2b, c）。对RAF1结合最重要的界面残基包括带电残基（E37, D38）和疏水残基（I36,Y40）。D38的任何突变都伴随着结合亲和力的变化，表明该位点对负电荷和特定侧链长度都有要求（图2d, e）。相比之下，E37可以被D、Y、F 、H取代，表明到RAF1 R67的盐桥可以被涉及芳香族侧链的相互作用取代。Y40只能被F取代表明了与RAF1 R89发生阳离子相互作用的芳香族侧链的重要性。I36与RAF1有两个疏水接触，这个位置的极性突变是有害的，而多个疏水取代是可以的。与RAF1接触的其他残基的突变结果表明这些位点对结合不太重要。

图2. KRAS-RAF1结合界面突变的自由能变化

接下来作者试图探究结合界面之外的突变带来的影响。74个残基中总共有361个远端突变，其结合自由能的增加程度大于RAF1结合界面中突变的平均作用（图3a）。以这种方式定义的变构突变高度富集于KRAS的生理变构位点，也就是核苷酸结合口袋。作者关注了许多不同突变后具有强变构效应的残基，并将主要变构位点定义为突变时结合自由能的平均绝对变化大于等于结合界面残基的残基，共确定了18个位点。其中有 10 个位于核苷酸结合口袋，而另外8个新的主要变构残基中有5个位于KRAS的中心β片上（图3b, c）。并且与RAF1接触的第一条链上的残基突变的结合自由能变化最大，并且在随后的每条链上逐渐减少，变构交流似乎在KRAS的中心β片上十分有效（图3d, e）。

随后作者聚焦于KRAS表面的四个口袋（图3f, g）。口袋1位于中心β片和α螺旋2之间，是多种抑制剂的结合位点。口袋2位于switch II和α螺旋3之间，是sotorasib（KRAS变构抑制剂）的结合位点。突变或使用小分子结合口袋1和口袋2都可以变构抑制KRAS活性。口袋3位于蛋白质的C端，距离RAF1结合界面最远，且在治疗开发中很少受到关注。该研究中发现口袋3的6个残基中有20个突变抑制了与RAF1的结合，因此口袋3应该优先作为KRAS抑制剂开发的一个位点。最后，紧挨在柔性效应结合环后面的口袋4在9个不与RAF1接触的残基中包含105个变构突变。因此KRAS的所有四个表面口袋都具有变构活性，可以进一步开发针对四个口袋的KRAS抑制剂。

图3. KRAS与RAF1结合的别构调控

像大多数癌蛋白一样，KRAS会结合许多不同的蛋白质，从而发挥其生理和疾病相关功能。因此接下来作者试图量化KRAS与多个互作蛋白的结合，从而确定信号中枢中变构效应的保守性和特异性（图4a）。作者量化了超过26,000个KRAS变体与六个互作蛋白的结合：3 个KRAS效应蛋白RAF1、 PIK3CG和RALGDS，GEF SOS1以及两个DARPins -- K27 和 K55。作者使用MoCHI将热力学模型拟合到突变体的分子表型中，KRAS的每一个氨基酸变化都有七个相关的自由能变化:六个结合能和一个折叠能，这七个自由能图谱构成了超过22,000个热力学测量。其中RAF1与RALGDS的结合能与独立的体外测量结果具有极好的相关性（图4b, c）。

图4. 7个KRAS自由能图

接下来作者试图探究结合界面的突变对六个互作蛋白结合的影响。所有六种蛋白都通过一组重叠的接触结合KRAS，且在三种效应蛋白中更为明显（图5a-c）。比较突变效应可以发现，尽管一些残基对于三种效应蛋白的结合至关重要，但许多取代能够改变结合特异性（图5d）。比较所有六个互作蛋白的结合自由能，可以发现通过单个氨基酸替换就可以达到惊人的特异性变化的多样性。

图5. KRAS相互作用表面的能量图谱

随后作者继续探究结合界面外突变效应的特异性。首先关注每个互作中变构突变最丰富的位置，将每个互作的主要变构位点定义为所有结合界面中平均绝对结合自由能变化大于等于突变平均值的位置。所有6个互作蛋白都鉴定出了新的主要变构位点，核苷酸结合口袋中有9个主要变构位点，每个互作平均还有5.5个额外的主要变构位点（图6a）。然后比较了这些位置上突变的所有六个互作蛋白之间的结合自由能变化（图6b）。许多变构位点的多重突变抑制了与所有互作蛋白的结合，表明这些位点的结合通常可能抑制KRAS的功能。图6b也揭示了主要变构位点的一系列突变具有更特异的变构效应。例如残基K16、I55、G60和F156中的许多突变变构地抑制了大多数互作蛋白的结合，但变构地增加了与DARPin K27的结合。

图6. 结合特异性的别构控制

综上所述，作者绘制了第一张蛋白质抑制性变构位点的图谱，以及突变对蛋白质与多个互作蛋白结合的自由能图谱。该数据集包含超过22,000个自由能测量值，是蛋白质生物物理学和计算生物学的丰富资源。并且该研究揭示了KRAS蛋白变构交流的重要原理，为开发靶向药物提供了众多位点。

供稿 | 娄鑫垚

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲  雨萱

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06954-0

参考文献

参考文献

1. Amberger, J. S., Bocchini, C. A., Scott, A. F. & Hamosh, A. OMIM.org: leveraging knowledge across phenotype-gene relationships. Nucleic Acids Res. 47, D1038–D1043 (2019).

2. Cook, J. H., Melloni, G. E. M., Gulhan, D. C., Park, P. J. & Haigis, K. M. The origins and genetic interactions of KRAS mutations are allele- and tissue-specific. Nat. Commun. 12, 1808 (2021).

3. Lu, S. et al. Ras Conformational Ensembles, Allostery, and Signaling. Chem. Rev. 116, 6607–6665 (2016).

4. Ostrem, J. M., Peters, U., Sos, M. L., Wells, J. A. & Shokat, K. M. K-Ras(G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions. Nature 503, 548–551 (2013).

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